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蛋白质提取及液内酶解

1、           试剂及配方

(1)     蛋白样品裂解缓冲液(lysis buffer, LB8 M尿素, 2 M硫尿, 4%CHAPS, 20 mM Trisbase, 30 mM DTT

尿素Urea(60.06)                480.48 g                     4.805 g                       9.61 g

硫脲thiourea (76.12)          152.24 g                     1.522 g                       3.044 g

CHAPS(614.9)                   40 g                            0.4 g                           0.8 g

Tris(121.3)                           2.426 g                       0.024 g                       0.048 g

DTT(154.2)                         4.626 g                       0.046 g                       0.092 g

超纯水溶解,定容至        1000mL                      10 mL             20 mL

分装,-20保存。

(2)     40 mM NH4HCO3水溶液,4保存

(3)     100 mM DTT溶液(用40 mM NH4HCO3水溶液配制),-20保存

(4)     100 mM IAA溶液(用40 mM NH4HCO3水溶液配制),-20避光保存

(5)     5 M urea 水溶液,4保存

2、           蛋白提取方法

(6)     样品:LB=1:10,冰浴研磨(先加少量LB,防止样品漂浮在研磨棒研磨头的上部;触角等不易研磨的组织,可以加液氮+石英砂,研钵研磨),待样品无明显的颗粒悬浮物后,样品置于冰上,用破碎仪破碎(破碎3-5秒,停止10-15秒,重复40次左右;蜂王浆、蜂毒等可以直接加LB后超声处理)。

(7)     414,000 g,离心15min×2次,取上清,注意避开脂肪层。上清加入3倍体积预冷的丙酮溶液,混匀后冰上静置30 min(若沉淀较少可延长沉淀时间)。414,000g,离心15min,弃上清,使丙酮充分挥发,得到蛋白沉淀(可丙酮洗沉淀1-2)

(8)     LB溶解,浓度测定(按试剂盒提供方法进行)

Note: 若进行液内酶解,跳过步骤(8),直接进行步骤(9))

3、           液内酶解

(9)     沉淀用适当体积的5 M Urea溶解,超声,Urea的体积以充分溶解沉淀为宜,常用100 µL,若不易溶解,可4放置过夜。加入4倍体积的40 mM NH4HCO3溶液,混匀。

(10)           还原:加入上述总体积1/10体积的 100 mM DTT,室温, 30min-1h

(11)           烷基化:加入5DTT体积的100 mM IAA溶液,室温,避光,30min-1h

(12)           蛋白浓度测定(按试剂盒方法进行)。

(13)           150~100的酶/底物(W/W)比加入胰酶,37ºC孵育过夜(12~14 h)。

(14)           酶解终止:加入1µL甲酸终止酶解。

(15)           14,000g,离心10 min,取上清(富集分析用;若直接上质谱,进行15,16)。

(16)           浓缩:上清真空干燥浓缩。

(17)           50 µL左右 0.1%甲酸溶解,离心取上清上样。

备注:超滤辅助的样品处理方法(FASP):从步骤8开始,可以引入Filter Unit,处理完每一步后均进行离心。

优点:

1)蛋白酶解前多余的UADTTIAA等样品处理中使用的小分子,以及样品中有可能影响酶解的小分子被超滤除去,提高酶解效率;

2)样品中的核酸,不能被酶解的分子量较大的多肽及聚合物等会影响质谱检测大分子都被截留在超滤管中;

3)可以引入SDS,适用于膜蛋白的提取,通过离心除去SDS,解决SDS与质谱无法兼容的问题;

缺点:

分子量比较小的蛋白或多肽因不能被Filter Unit截留而丢失。

 

 

磷酸化肽段富集

Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) 富集

(一)固相金属离子亲和层析

1IMAC材料的制备

(1)    按照GTP(固相金属离子亲和层析基质)材料:Ti(SO4)2=1/100M/M)制备。称GTP材料200 mg,加入250 mL水,磁力搅拌混匀。后加入20 g Ti(SO4)2,室温,磁力搅拌过夜。

(2)    将搅拌好的悬浊液转移到15 mL离心管中(一次可用多个离心管),20000 RPM5 min,去上清。向去上清后的离心管中继续加入悬浊液直到全部离心处理完毕。

(3)    水洗:向步骤2的沉淀中加入一定体积的水,震荡洗涤未键合的Ti4+20000 RPM,离心5 min,弃上清。重复6次,目的是尽量洗干净Ti4+

(4)    盐洗:使用200 mM NaCl 水溶液洗涤IMAC材料2次,20000 RPM,离心5 min,弃上清。

(5)    水洗:盐洗之后的IMAC材料,再用水洗涤2-3次。20000 RPM,离心5 min,弃上清。

(6)    30 mL水溶解,分装,离心去上清,真空干燥。

(7)    分装:5 mg/管。4ºC保存备用。

2IMAC富集

(8)    向制备好的IMAC材料中加入500µL Binding Buffer (80%ACN, 6%TFA水溶液),震荡后加入酶解后的样品溶液,并根据加入的体积补加TFA,使TFA的终浓度保持6%v/v)。室温震荡2h14000g5min,弃上清。

(9)    加入1mL Washing Buffer I (50%ACN, 6%TFA, 200 mM NaCl水溶液),震荡30 min14000g5min,弃上清。

(10) 加入1mL Washing Buffer II (30%ACN, 0.1%TFA水溶液),震荡30 min14000g5min,弃上清。

(11) 加入100 µL Elution Buffer (500 mM K2HPO4水溶液),震荡30 min

(12) 14000g10 min,取上清。重复步骤4,合并上清。

3Zip-Tip除盐

(13) Zip-Tip C18活化:用活化液(50%ACN, 0.3%TFA水溶液)活化Zip-Tip C18填料,吸吹10次;

(14) Zip-Tip C18平衡:平衡液(0.1%TFA水溶液)吸吹10次;

(15) 肽段富集:用活化、平衡后的Zip-Tip抽吸样品10次(避免产生气泡);

(16) 除盐:用水吸吹3-5次,洗去Zip-Tip上的盐分;

(17) 洗脱:50 µL左右洗脱液(80%ACN, 0.1%TFA水溶液)抽吸10次;

(18) 重复步骤3-5,重复3-5次;

(19) 干燥。

(二)TiO2富集

1TiO2材料的制备

称取9 mg TiO2 + 40 mg dihydroxy-benzoic acid (DHB),加入500 μL Binding Buffer (80% ACN, 6%TFA水溶液)震荡混匀,用于1份样品的富集。

2、磷酸化肽段的TiO2富集

1)向制备好的TiO2材料中加入酶解后的肽段溶液(约500 μL),补加TFA,使TFA的终浓度为6% (V/V), 室温震荡2 h14000 g5 min,弃上清。

2)加入1 mL Washing Buffer I (50%ACN, 6%TFA, 200 mM NaCl水溶液),室温震荡30 min14000 g5 min,弃上清。

3)加入1mL Washing Buffer II (30%ACN, 0.1%TFA水溶液),室温震荡30 min14000g5min,弃上清。

4)加入100 µL Elution Buffer (500 mM K2HPO4水溶液),室温震荡30 min

514000g10 min,保留上清。充分步骤(4)。

6)合并上清,除盐,干燥。

 

N-linked糖基化

(一)N-糖蛋白富集---酰肼法 (hydrazide)

1、试剂

(1) Coupling Buffer (100 mM Sodium Acetate, NaAC醋酸钠; 150 mM Sodium Chloride, NaCl氯化钠; pH 5.5)

NaAC (82.03)     0.410 g

NaCl (58.4)         0.423 g

超纯水适量溶解,调节pH5.5,定容至50 mL

(2) Sodium Periodate Stock solution (50 mM NaIO4, 高碘酸钠)

NaIO4 (213.89)         0.107 g

超纯水至10 mL,避光存放,尽量现用现配(4可存放一周

(3) 40 mM NH4HCO3

NH4HCO3 (79.05)     0.158 g

加超纯水溶解至50 mL4°C存放

(4) 100 mM Iodoacetamide (IAA, 碘乙酰胺)

IAA (185.0)        0.185 g

40 mM NH4HCO3溶解至10 mL1 mL/管分装,-20°C存放

2、富集方法

1)      After precipitated with acetone, the protein pellet (about 1~2 mg) was suspended in 250 μL coupling buffer.

2)      Add 100 μL 50 mM NaIO4 for glycoprotein oxidation at RT, keep from light and agitate for 1 h.

3)      hydrazide equilibration

3.1  250 μL hydrazide+750 μL ddH2O, 14,000 g for 5 min, discard the supernatant; repeat for 3 times.

3.2  Add 750 μL coupling buffer, 14,000 g for 5 min, discard the supernatant; repeat for 3 times.

3.3  Add 250 μL coupling buffer, agitate thoroughly.

4       Mix the protein solution with the equilibrated hydrazide solution, agitate at RT for 24 h, 14, 000 g for 5 min, discard the supernatant.

5       Desalting

5.1  Add 1 mL ddH2O, mixed and centrifuged at 14 000 g, 4 °C for 3×5 min, discard the supernatant.

5.2  Add 1 mL 40 mM NH4HCO3, mixed and centrifuged at 14 000 g, 4 °C for 3×5 min, discard the supernatant.

6       Suspend the precipitation with 250 μL, 40 mM NH4HCO3.

7       Add 50 μL, 100 mM DTT for protein reduction, RT for 30~60 min.

8       Add 250 μL, 100 mM IAA for protein alkylation, RT for 30~60 min, keep in darkness.

9       Trypsin digestion. Trypsin: protein=1:50~100 (w/w), 37 °C overnight (12-14h).

10    Add 1 μL formic acid to stop the digestion, centrifuge at 14, 000 g, 4 °C for 5 min, discard the supernatant.

11    Wash the precipitation with 1 mL ddH2O, centrifuge at 14, 000 g, 4 °C for 5 min, keep the precipitation and repeat for 3 times. Followed by 30% ACN, ddH2O and 40 mM NH4HCO3, respectively.

12    Add 150~200 μL, 40 mM NH4HC18O3 (NH4HCO3 dissolved in H2O18), agitate.

13    Add 5μL PNGase F to release the N-linked glycans, incubate at 37 °C overnight (12~14h).

14    Add 1 μL formic acid to stop the digestion, centrifuge at 14, 000 g, 4 °C for 15 min, keep the supernatant.

15    Wash the precipitation with 80% ACN (diluted by H2O18), centrifuge at 14 000 g, 4 °C for 15 min, keep the supernatant. Repeat twice.

16    Pool the supernatant and concentrate for MS analysis.

Note: All the steps related to H2O18 should be kept from light.

 

 () 糖肽富集---Lectin

1、试剂

1UA buffer8 M Urea/100mM Tris, pH 8.5

22 × Binding Buffer2 mM MnCl2, 2 mM CaCl2, 1 M NaCl/40 mM Tris, pH 7.6.

3Lectin CWR

Concanavalin A (6mg/mL, prepared with 2×Binding buffer)                      15 μL

Wheat Germ Agglutinin (6mg/mL, prepared with 2×Binding buffer)         15 μL

RCA120 Agglutionin Solution                                                                     6 μL

合并,震荡混匀,-20 °C保存备用。

2、富集

1.     Suspend the Protein pellet (about 1~2 mg) in 200 μl UA buffer, 14, 000 g, 4 °C for 15 min, pipette the supernatant to the 0.5 ml filter unit.

2.     Add 200 μL UA buffer, 14 000 g for 15 min.

3.     Discard solution in the collection tube.

4.     Add 50 μL, 100 mM DTT for protein reduction, resuspend the pellet with tips, RT for 30~60 min.

5.     Add 250 μL, 100mM IAA solution, resuspend the pellet with tips, incubate for 30~60 min in darkness, 14, 000 g for 15 min.

6.     Add 200 μL UA to the filter unit, resuspend the pellet with tips, 14 000 g for 15 min. Repeat this step twice.

7.     Add 200 μL, 40 mM NH4HCO3 to the filter unit, resuspend the pellet with tips, 14,000 g for 15 min. Repeat this step twice.

8.     Trypsin digestion. Add trypsin (enzyme :protein= 1:50~100) to the filter unit, resuspend the pellet with tips, use a new collection tube, mix for 1 min, incubate at 37 °C overnight.

9.     Add 1μL formic acid to stop the digestion, 14 000 g for 15 min.

10.  Add 50 μL 1×Binding Buffer to the filter unit, 14 000 g for 2×15 min.

11.  Discard the filter unit, add 36 μL lectin CWR to the collection tube, agitate for 1 h at RT.

12.  Transfer the solution to a new filter unit, 14 000 g for 15 min.

13.  Add 100 μL 1×Binding Buffer to the filter unit, 14 000 g for 15 min. Repeat this step for 4 times.

14.  Add 200 μL, 40mM NH4HCO3 to the filter unit, 14 000 g for 15 min. Repeat this step for 3 times.

15.  Add 50 μL, 40 mM NH4HC18O3 (dissolved NH4HCO3 in H2O18), 14 000 g, for 5 min.

16.  Add 150~200 μL, 40 mM NH4HddC18O3 to the filter-unit and agitate.

17.  Add 5μL PNGase F to relase the N-linked glycans, incubate at 37 °C overnight.

18.  Add 1μL formic acid to stop the digestion, transfer the filter unit to a new collection tube, 14 000 g 15 min.

19.  Add 50~100 μL, 40 mM NH4HC18O3, 14 000 g, for 10 min, repeat twice.

20.  Concentrate the solution in the collection tube for MS analysis.

 

(三)Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography (HILIC)法富集

1、试剂

(1) HILIC binding buffer 80% (vol/vol) ACN0.1% (vol/vol) TFA(效果优于FA

Or 80% (vol/vol) ACN1% (vol/vol) FA

(2) HILIC washing buffer 0.1% (vol/vol) TFA OR 0.1% (vol/vol) FA

2HILIC富集糖肽

1) 将肽段真空抽干,加500 μL binding buffer 重溶,充分震荡30min

2)称取10 mg HILIC填料,加入200 μL washing buffer活化HILIC,充分震荡30 min1,000×g 离心1 min,去上清。肽段的量约为100 μg

3) 加入200 μL binding buffer,涡旋1 min1,000×g 离心1min,去上清。重复一次。

4) 将重溶的肽段样品加入HILIC填料中,充分震荡1 h

5) 将结合肽段的HILIC填料加入已填C18堵头的200 μ       L枪头中(用超滤柱代替),用注射器将溶液排出并收集。

6) 向滤芯中加入100 μL binding buffer,排出溶液,重复2次。

7) 向滤芯中加入100 μL washing buffer,收集洗脱液,重复5次。

8) 将步骤7中收集的溶液抽干,加入100 μL40 mM NH4HC18O3复溶,5 μL PNGase F酶,37ºC酶解过夜;

9) FA终止反应,真空浓缩干燥。

 

Western blot

1、蛋白质提取、浓度测定同上。

2、凝胶配制

                                          分离胶                浓缩胶 

              30%胶储液         1.33 mL               0.223 mL

              2buffer              2 mL                    0.333 mL

                     H2O              0.67 mL               0.443 mL     

              TEMED                     2 μL                    1.33 μL

              10%AP                25 μL                  8.3 μL

                                          一块胶                一块胶

3、样品制备:

              样品配制成统一的浓度,加入Loading Buffer后煮沸,根据目标蛋白的丰度选择合适的配制浓度和上样体积(Mini Gel 一个孔道最多约可上样15~20 μL)。

4、电泳

恒压法:80 V,当指示剂前言进入分离胶后,电压升至120 V保持至电泳结束。

5、湿法转膜

       110转膜原液配制

Tris-base 30.0 g

Glycine (甘氨酸) 144.0 g

纯净水定容至1000 mL

2)转膜液:1转膜原液:甲醇=4:1

Bio-RAD湿法转膜装置

 

3三明治的组装:gel holder黑的一面在最下面,自下而上依次放置:

a)       Filter Pad转膜液预湿的纤维垫;

b)       Filter Paper转膜液预湿的滤纸(普通滤纸需加两层);

c)       Gel

d)      MembrancePVDF膜使用之前,用甲醇浸泡1~2 min进行活化。PVDF膜处理前是疏水性的膜,经过甲醇处理后,活化PVDF膜上面的正电基团,使它更容易跟带负电的蛋白质结合);

e)       Filter paper转膜液预湿的滤纸(普通滤纸需加两层);

f)        Filetr Pad转膜液预湿的纤维垫;

组装过程中应避免在接触面之间产生气泡,滤纸大小应小于膜,避免滤纸直接接触。之后将gel holder合起,并用卡钳卡紧,放入electrode module中,黑的一面朝向电极模块的黑面。

4)转膜

       将组装好后的electrode module放入电泳槽中,加入转膜液和预冷的降温槽(U型水槽,用前先加水冻成冰),盖上盖子,注意区分电极(转膜过程容易产生大量的热,可在电泳槽外围加冰或冰袋,提高降温效果)。根据目的蛋白分子量的大小,调整转膜电压及时间,一般40 kDa常用120 V, 1.5 h左右。

6、膜封闭

a)       10TBS溶液

                     Tris-base       24.2 g

                     NaCl             80 g

                     超纯水定容至1000 mLpH 7.6

b)       1TBST洗膜2~3次。

1TBSTween 20=10001

c)       封闭:将洗过的膜放入5%的脱脂奶粉(用1TBST配制)中,室温震荡1 h

d)      1TBST溶液洗膜3次。

7、一抗孵育

       1TBST将一抗稀释至说明书推荐的范围,加入膜中,室温孵育1h(也可选择4 ºC孵育过夜)。去除一抗,1TBST洗膜3~5遍。

8、二抗孵育,

       1TBST将二抗稀释至说明书推荐的范围,加入膜中,室温孵育1h。去除二抗,1TBST洗膜3~5遍。

9、曝光

     将洗好的膜转移至保鲜膜上,发光底物AB11的体积比混合后均匀加至膜上,室温孵育3~5min,曝光。

 

银染胶内点酶解

1、脱色

1.1 超纯水洗200 μL/管,震荡,3-5 min/次,共3次,弃上清。

1.2 每管中加入新鲜制备的100 μL脱色工作液〔30 mM K3Fe (CN) 6(取0.988K3Fe (CN) 6溶至超纯水100 mL:100 mM Na2S2O3(取1.58Na2S2O32.48g五水Na2S2O3溶至超纯水100 mL=11〕,放置并晃动直到胶粒的棕色消失,去上清。

1.3 用去离子水冲洗三次终止反应,去上清。

1.4 每管中加入100 μL 100 mMNH4HCO30.79NH4HCO3溶于100 mL超纯水中),洗胶三次,弃上清。

2、干燥

每管中加入100 μL 无水乙腈(ACN)脱水2遍至胶粒缩小变白,去ACN,真空干燥10-15 min

3、酶解

每管加入10 μL胰蛋白酶(10 ng/μL,溶剂为40 mM NH4HCO3),4放置1 h,待胶粒充分泡涨后,吸去多余酶液,37消化过夜(12~14h)。

4、萃取

4.1 每管中加入20 μL (胶粒大的话可以适当多加)萃取液5 %TFA,三氟乙酸)萃取一次,371小时,上清液移至另一新管中。

4.2 再向原管中加入20 μL(同上)萃取液2.5 %TFA/ 50 %ACN)萃取一次,301小时,上清移至4.1的上清液中,将两次萃取液合并后真空抽干。

5、质谱分析

抽干后的样品用20-30 μL 0.1% FA(甲酸水溶液)溶解,14 000 g离心,取上清上样。

 

考染胶内点酶解

1、脱色

每管中加入脱色液(50%乙腈,25 mM NH4HCO3)(乙腈50 mLNH4HCO3 0.198 g,超纯水至100 mL200 μL,震荡,反复数次,直至胶粒无色。

2、干燥

每管中加入100 μL 无水乙腈(ACN)脱水2遍至胶粒缩小变白,去ACN,真空干燥10-15 min

3、酶解

每管加入10 μL TPCK-胰蛋白酶(10 ng/μL,溶剂为40 mM NH4HCO3),4放置1h,待胶粒充分泡涨后,吸去多余酶液,37 消化过夜(<14h)。

4、萃取

4.1 每管中加入20 μL(胶粒大的话可以适当多加)萃取液5 %TFA,三氟乙酸)萃取一次,371小时,上清液移至另一新管中。

4.2 再向原管中加入20 μL(同上)萃取液2.5 %TFA/ 50 %ACN)萃取一次,301小时,上清移至4.1的上清液中,将两次萃取液合并后真空抽干。

5、质谱分析

抽干后的样品用20-30 Μl 0.1% FA(甲酸水溶液)溶解,14 000 g离心,取上清上样。

 

银染胶内条带酶解

1、脱色

1.1 超纯水洗200 μL/管,3-5min/次,共3次,弃上清(注:此处液体体积为常用体积,添加液体的量应以可以淹没管内的胶粒为准,请根据胶粒的量自行调整,下同)。

1.2 每管中加入新鲜制备的100 μL脱色工作液〔30 mM K3Fe (CN) 6(取0.988K3Fe (CN) 6溶至超纯水100 mL:100 mM Na2S2O3(取1.58Na2S2O32.48 g五水Na2S2O3溶至超纯水100 mL=11〕,震荡至蛋白点的棕色消失(约23 min),去上清

1.3 马上用去离子水冲洗三次停止反应,去上清

1.4 每管中加入100 μL 100 mMNH4HCO30.79NH4HCO3溶至100 mL超纯水中),洗胶三次,弃上清

2、干燥

每管中加入100 μL 无水乙腈(ACN)脱水2遍至胶块缩小变白,去上清,真空干燥到完全干燥为止

3、还原

每管中加入足够完全覆盖胶块的10 mMDTT,室温放置1h,吸去多余的溶液。

4、干燥

每管中加入100 μL 无水乙腈(ACN)脱水2遍至胶块缩小变白,去上清,真空干燥到完全干燥为止

5、烷基化

每管中加入与DTT等体积的50 mMIAA0.925碘乙酰胺,0.79NH4HCO3溶至100 mL超纯水中),室温避光放置1 h,吸去多余的溶液。

6、干燥

每管中加入100 μL 无水乙腈(ACN)脱水2遍至胶块缩小变白,去上清,真空干燥到完全干燥为止

7、原位酶解

每管加入足够完全覆盖胶块的胰蛋白酶(10 ng/μL,溶剂为40 mM NH4HCO3),4放置1h,待酶液完全被吸收后,吸去多余酶液,.37 消化过夜(10~14 h)。

8、萃取

8.1 每管中加入200 μL 萃取液5 %TFA)萃取一次,371 h,上清液移至另一新管中。

8.2 每管中加入200 μL萃取液2.5 %TFA/ 50 %ACN)萃取一次,301 h,上清移至8.1的上清液中,将两次萃取液合并后真空抽干至20μl

 

考染胶内条带酶解

1、脱色

每管中加入脱色液(50%乙腈,25 mM NH4HCO3)(乙腈50 mLNH4HCO3 0.198 g,超纯水至100 mL200 μL,反复数次,直至胶块无色

2、干燥

每管中加入100 μL 无水乙腈(ACN)脱水2遍至胶块缩小变白,去上清,真空干燥到完全干燥为止

3、还原

每管中加入足够完全覆盖胶块的10 mMDTT0.154DTT0.79NH4HCO3溶至100 mL超纯水中),室温放置1Hr,吸去多余的溶液。

4、干燥

每管中加入100 μL 无水乙腈(ACN)脱水2遍至胶块缩小变白,去上清,真空干燥到完全干燥为止

5、烷基化

每管中与DTT等体积的50mMIAA0.925 g IAA0.79 g NH4HCO3溶至100ml超纯水中),室温避光放置1 h,吸去多余的溶液。

6、干燥

每管中加入100 μL 无水乙腈(ACN)脱水2遍至胶块缩小变白,去上清,真空干燥到完全干燥为止

7、原位酶解

每管加入足够完全覆盖胶块的胰蛋白酶(10 ng/μL,溶剂为40 mM NH4HCO3),4放置1h,待酶液完全被吸收后,吸去多余酶液,.37 消化过夜(10~14 h)。

8、萃取

8.1 每管中加入20 μL 萃取液5 %TFA)萃取一次,371 h,上清液移至另一新管中。

8.2 每管中加入20 μL萃取液2.5 %TFA/ 50 %ACN)萃取一次,301 h,上清移至8.1的上清液中,将两次萃取液合并后真空抽干至20 μL


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